par Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Groupe d'entreprises Blue Aqua International, Thaïlande
L'aquaculture de crevettes a été considérablement affectée par de nombreuses maladies pathogènes, principalement causée par V. parahaemolyticus et le virus du syndrome des points blancs (WSSV). Le but de cette étude était d'évaluer l'utilisation potentielle de deux additifs alimentaires fonctionnels AlphaGuard*L Plus (Liquide) et AlphaGuard*P (Poudre) composés d'huiles essentielles (eucalyptus, thym, origan appartenant respectivement à la famille des Myrtacées et des Lamiacées), Triglycérides à chaîne moyenne (TCM) et composés bioactifs naturels des crevettes contre les agents pathogènes pathogènes, en particulier V. parahaemolyticus et WSSV.
Les résultats ont indiqué qu'AlphaGuard*L Plus retardait efficacement la progression de la maladie chez les crevettes. Ces résultats suggèrent que l'additif alimentaire fonctionnel AlphaGuard*P et AlphaGuard*LPLUS pourrait être utilisé afin de promouvoir la défense des crevettes contre les agents pathogènes.
introduction
La pratique de l'intensification de l'aquaculture est entravée par la santé et la nutrition qui affectent les performances de croissance. Pour démêler ces conséquences, des additifs alimentaires fonctionnels ont été utilisés pour stimuler le système immunitaire des crevettes et améliorer les performances des crevettes, en particulier pour contrôler les agents pathogènes viraux et bactériens. Maladie (WSD), combinée à la mise en place de mesures de biosécurité.
La composition d'AlphaGuard composant le MCT et l'huile essentielle sont reconnues comme pratique GRAS. Dans cette étude, l'efficacité du produit AlphaGuard a été obtenue par une combinaison des données des résultats des tests de diffusion sur disque, défis de la maladie et histologie, ainsi qu'une évaluation des effets du produit AlphaGuard sur les maladies des crevettes.
matériaux et méthodes
Bactéries et virus pathogènes
Deux agents pathogènes virulents chez les crevettes, V. parahaemolyticus et V. harveyi en stock de glycérol, ont été repiquées dans du Tryptic Soy Broth (TSB) + un pour cent de NaCl, incubé à 37oC pendant 24 heures, avant de strier sur gélose thiosulfate-citrate-sels biliaires-saccharose pour obtenir sa culture pure.
La suspension de WSSV a été préparée à partir du muscle de crevettes infectées par le WSSV. Brièvement, le WSSV dans le muscle de crevette a été retiré du stockage à -80°C et coupé en morceaux uniformes dans des conditions stériles froides puis homogénéisé dans du tampon TN (20 mM Tris-HCl, 400 mMNaCl, pH 7,4) à 0,1 g/ml.
Après centrifugation à 2, 000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C, le surnageant a été dilué à 1:100 avec 0,9 pour cent de NaCl et filtré à travers 0,45 micron. Le surnageant résultant a été conservé à -80°C, jusqu'à ce qu'il soit utilisé comme source d'injection de WSSV pour les expériences de provocation.
L'activité antimicrobienne
Test de diffusion sur disque
5 µl d'AlphaGuard*L Plus et AlphaGuard*P, concentration allant de 0, 0,25, 0,5, 1,0 et 10 pour cent de dilution avec NaCl 0,85 pour cent, ont été absorbés dans cinq millimètres de diamètre, Disques de papier de 0,9 mm d'épaisseur puis séchés à l'air avant d'être placés dans 105 cellules de culture bactérienne dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm de large. Une solution à 0,85% de NaCl a été utilisée comme contrôle négatif. Trois plaques répétées pour chaque traitement ont été utilisées et les observations ont été enregistrées après 24 heures.
Infection artificielle à V. parahaemolyticus et détermination du nombre de Vibrio dans l'hémolymphe (HL) et l'hépatopancréas (HP) de la crevette
V. parahaemolyticus a été réactivé à partir du stockage à -80°C et cultivé dans du TSB + un pour cent de NaCl à 37°C pendant une nuit. La culture a été centrifugée à 5, 000 tr/min pendant 10 minutes, éliminer le surnageant, et le culot a été remis en suspension dans 0,85 pour cent de NaCl stérile à une densité de 8,4 x 106 CFU/ml.
Les crevettes, la cinquième semaine, ont été infectés en injectant 100 L de la suspension bactérienne dans le deuxième segment abdominal de crevettes saines à la cinquième semaine de culture et la mortalité a été enregistrée pendant sept jours.
Les crevettes ont été collectées au hasard le troisième jour après l'infection pour chaque traitement et lavées trois fois avec de l'eau stérile. HL a été retiré de la cavité péricardique à l'aide d'une seringue jetable stérile d'un ml dans des conditions stériles et ajouté à un volume égal d'anticoagulant stérile (en ajoutant 10 mM d'EDTA-Na2 à 450 mMNaCl, 10 mMKCl, 10 mM HEPES, pH 7,3, 850 mOsm.kg-1 ou 10 mM Tris-HCl, 250 mM de saccharose, Citrate de sodium 100 mM, pH 7,6).
La HL et la HP broyée ont été diluées en série 10 fois avec du PBS stérile froid. Chaque dilution a été étalée sur des plaques de gélose TCBS placées à l'envers dans un incubateur à 37°C et cultivée pendant 16 à 20 heures. Les plaques contenant 30 à 300 colonies bactériennes ont été comptées, puis les nombres ont été enregistrés en UFC/ml ou UFC/g.
Infection artificielle par le WSSV
ml du filtrat a été injecté par voie intramusculaire dans des crevettes saines à la cinquième semaine de culture. Des crevettes ont été prélevées au hasard six heures après l'infection pour un examen histopathologique et la mortalité f a été enregistrée pendant sept jours.
Conditions de croissance des crevettes et groupes expérimentaux
Les crevettes ont été achetées dans des fermes thaïlandaises locales. Ils ont été testés négatifs au V. AHNPD et WSSV causés par parahaemolyticus par analyse PCR. Après s'être acclimaté une semaine en aquarium, avant l'expérimentation, des crevettes apparemment saines avec une longueur de corps uniforme ont été divisées au hasard en trois groupes avec six répétitions par groupe, 20 crevettes par répétition.
La capacité de l'aquarium était de 100 litres, contenant 60 litres d'eau de mer. La propriété de l'eau saline a été maintenue à 15 ppt, pH 7,7-8,0 et OD>4,0 mg/L. Chaque traitement contient des crevettes juvéniles d'un poids initial moyen de 2,6 g, stockées au hasard dans chaque bac.
Les crevettes ont été nourries à satiété jusqu'à environ 2,5 à 3 pour cent de leur poids corporel, trois fois par jour pendant cinq semaines. L'alimentation a été ajustée quotidiennement, selon leur taux d'ingestion, pour s'assurer que les aliments ont été totalement consommés. Avant de se nourrir, mue, excréments, et les crevettes mortes ont été enlevées, 20 pour cent de l'eau de chaque réservoir était remplacée tous les trois jours par de l'eau de mer neuve.
Régimes expérimentaux et collecte de données
Tous les groupes ont été conservés, pendant l'expérimentation, dans les mêmes conditions que l'acclimatation. Le groupe témoin a été nourri avec des boulettes de crevettes commerciales, recouvert d'un pour cent de chitine-chitosane. Les groupes de traitement ont été nourris avec AlphaGuard*L Plus pulvérisé ou AlphaGuard*P, mélangé avec des boulettes de crevettes commerciales et enrobé d'un pour cent de chitine-chitosan, au dosage 5,0 ml ou g/Kg d'aliment. Les paramètres de mortalité et de qualité de l'eau ont été enregistrés quotidiennement. A la fin du procès, le taux de survie a été évalué.
analyses statistiques
Unités expérimentales d'analyse statistique, réservoirs, et les aquariums ont été distribués de manière complètement aléatoire. Les données quantitatives ont été vérifiées pour la normalité et l'homoscédasticité. Les données ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour rechercher une différence significative (p <0,05) entre les moyennes de traitement.
Résultats
L'activité antibactérienne par les méthodes de diffusion sur disque et l'inclusion dans l'alimentation des crevettes sur la résistance aux maladies d'AlphaGuard*L Plus ou d'AlphaGuard*P
Test de diffusion sur disque
Les concentrations d'AlphaGuard*L Plus et d'AlphaGuard*P au moins un pour cent inhibent à la fois V. harveyi et V. parahaemolyticus, cependant, il y avait une efficacité d'inhibition plus élevée pour V. parahaemolyticus que pour V. harveyi. La concentration efficace d'AlphaGuard aurait pu être abaissée si nous l'avions dilué dans des liposolubles, comme l'éthanol, pour tester.
Compositions d'huiles essentielles, les techniques de dosage et le mode d'action ont été examinés de manière approfondie. Cette étude n'a pas examiné les détails moléculaires de ses mécanismes, cependant, le principal effet des propriétés bactéricides pourrait être lié à leur interférence de l'intégrité et de la perméabilité de la membrane en tant que composé lipophile de l'huile essentielle et des MCT.
Différents acides gras dans les MCT ont une concentration minimale inhibitrice (CMI) différente, selon le type d'acide gras, micro-organisme, et le pH environnemental. L'aspect synergique et antagoniste entre les ingrédients d'AlphaGuard n'est pas élucidé dans cette étude. L'huile essentielle d'AlphaGuard agit également comme un antioxydant pour empêcher ou ralentir l'oxydation des MCT insaturés afin de prolonger sa durée de conservation en plus d'être anti-stress chez les crevettes.
Test de provocation contre V. parahaemolyticus
À la fin de l'expérience d'essai d'alimentation, les crevettes ont été attaquées par V. parahaemolyticus. Le taux de mortalité cumulé a été tracé (voir figure 2). Les résultats du taux de mortalité, après le défi de V. parahaemolyticus pendant un intervalle de sept jours, ont montré que les groupes de crevettes nourris avec AlphaGuard*P et AlphaGuard*L Plus avaient des taux de mortalité significativement inférieurs à ceux du groupe témoin après le quatrième jour d'infection.
AlphaGuard*P et AlphaGuard*L Plus présentaient le même taux de mortalité statistique après le cinquième jour d'infection. A la fin de l'expérimentation, en revanche, le taux de survie n'était pas statistiquement corrélé au taux de mortalité pour AlphaGuard*P, (voir figure trois).
La capacité de dépollution des crevettes de Vibrio spp. après trois jours d'infection a été tracée, (voir figure quatre). Les résultats ont indiqué que Vibriospp. le compte dans l'hémolymphe des crevettes nourries par AlphaGuard*P et AlphaGuard*LPlus était inférieur à celui des groupes témoins. La capacité des crevettes à se défendre contre les bactéries en HP, alimenté par AlphaGuard*LPlus, avait également une bien meilleure capacité de défense que les crevettes non nourries avec AlphaGuard.
Test de défi WSSV
Le test de provocation WSSV a été effectué après cinq semaines d'essai d'alimentation. La mortalité cumulée a été tracée, (voir figure cinq). Le groupe de crevettes nourries par AlphaGuard*L Plus a montré un retard significatif de la mortalité, par rapport aux groupes de contrôle et AlphaGuard*P-fedshrimp pendant leur deuxième, troisième et quatrième jours, (voir figure 6).
Cela coïncide avec l'absence de signe histopathologique de coloration H&E des tissus infectés par le WSSV au niveau de la zone d'injection, sauf la généralisation de la nécrose musculaire qui est vraisemblablement liée au mécanisme de défense de la crevette après trois jours d'infection. Néanmoins, tous les groupes se sont retrouvés avec une mortalité de 100 pour cent.
Conclusion
Les résultats de cet essai suggèrent que l'application de l'additif alimentaire AlphaGuard*P et AlphaGuard*L Plus à 0,5 pour cent avec des aliments commerciaux a prouvé l'efficacité de la promotion de la défense des crevettes contre les agents pathogènes. AlphaGuard*L Plus a surtout affiché une meilleure performance.
