Techniques de plantes de culture tissulaire pour les débutants

Techniques de plantes de culture tissulaire :

Introduction aux plantes de culture tissulaire :

La technique de maintien et de croissance des cellules végétales, tissus, et d'autres parties de la plante dans des conditions stériles dans un milieu nutritif est appelé « culture des tissus » dans les plantes. Cette technique ou culture tissulaire est utilisée à des fins de propagation. Par conséquent, cette méthode est également connue sous le nom de micropropagation. Par l'utilisation de cette méthode, un clone d'une plante est produit dans un environnement contrôlé puis propagé dans le milieu extérieur. La partie de la plante qui est utilisée pour la culture de tissus est appelée un « explanter » . Cette culture a été établie pour la première fois par Gottlieb Haberlandt en 1902. La capacité d'une cellule végétale à se régénérer en une plante entière est biologiquement appelée « totipotence cellulaire ». Les explants sont cultivés dans des conteneurs avec un milieu riche en nutriments. Tous les matériaux liés à la culture tissulaire sont stérilisés avant utilisation pour éviter les infections et la pourriture des tissus. Il existe différents types de culture tissulaire chez les plantes telles que la culture de callosités, Culture d'orgue, Culture unicellulaire, Culture des suspensions, Culture d'embryons, Anthère Culture, Culture du pollen, Embryogenèse somatique, Culture de protoplastes, Pointe de pousse et culture de méristème et culture d'explant. Les trois principaux aspects de l'environnement requis pour la culture tissulaire sont le milieu nutritif (le mélange de sels, vitamines, nutriments, et autres stimulateurs de croissance), les conditions aseptiques (stérilisation), et l'aération du tissu (comprend l'agitation du milieu). La culture de tissus dans les plantes devrait subir quatre étapes avant d'être réellement propagée dans l'environnement extérieur. Les étapes sont :

Étape 1 ou phase d'initiation :L'explant qui doit être cultivé est stérilisé pour éviter le développement de micro-organismes qui pourraient nuire au processus.

Étape 2 ou la phase de multiplication :Dans cette étape, l'explant est redivisé et introduit dans le milieu. Ici, le tissu prolifère et produit de nouvelles pousses.

Étape 3 ou formation des racines :Les hormones sont utilisées pour induire l'enracinement et les explants sont préparés pour être transférés dans les milieux de culture habituels.

Étape 4 ou phase d'établissement :Les propagules sont finalement déplacées vers les conditions extérieures du sol.

Avantages des plantes de culture tissulaire :

• Un grand nombre de plantules peut être cultivé en moins de temps et d'espace avec un seul explant.
• Les tissus des plantes sont influencés par d'autres témoins corrélatifs végétaux qui peuvent être isolés dans cette technique.
• La même réplique de plantes est créée pour produire de bonnes plantes fruitières et fleuries.
• Cette méthode est extrêmement rapide pour produire des plantes matures.
• Lorsque les graines ou les pollinisateurs ne sont pas disponibles, alors cette technique est utile.
• Une nouvelle espèce de plante génétiquement modifiée peut être développée.
• Les conditions stériles ont moins de risques de maladies, parasites, et d'autres agents pathogènes.
• Les graines qui ont moins de possibilités de germination comme les orchidées et les Nepenthes peuvent être cultivées grâce à cette méthode.
• Les propagules peuvent être stockées longtemps dans une petite zone.

Inconvénients des plantes de culture tissulaire :

• Cette technique peut nécessiter 70 % de main-d'œuvre en plus et est coûteuse.
• Les plantes développées dans un environnement conditionné ont tendance à perdre leur résistance aux maladies. Il y a donc un risque que les plantes soient vulnérables aux mêmes infections.
• Un échantillon de tissu végétal profondément infecté peut produire une plante infectée s'il n'est pas correctement dépisté pour les virus et l'infection avant d'effectuer la culture.
• Il n'est pas vrai que toutes les plantes soient cultivées avec succès; parfois, les produits chimiques métaboliques secondaires des plantes peuvent tuer l'explant ou retarder sa croissance.

Lisez ceci:Informations sur la culture de tissus de banane.

Plantes cultivées à l'aide de la technique des plantes de culture tissulaire :

Les plantes qui ont été cultivées avec succès en utilisant la technique de culture tissulaire sont la banane, Ananas, Figure, Parval, Tindore, Citron, Gingembre, Patate douce, Canne à sucre, Tomate, Pomme de terre, Choux, Papaye, Mangue, Goyave, Fraise, Curcuma, Jatropha, Eucalyptus, Teck, Orchidées, Bambou, etc.

Matériel requis pour les plantes de culture tissulaire :

Si la culture tissulaire est pratiquée à domicile, alors il y a quelques matériaux disponibles qui peuvent être utiles.

• Longs pots de nourriture pour bébé.
• Bouchons phyto pour couvrir les pots.
• Forceps.
• Médias (Murashige et Skoog avec des vitamines).
• pH-mètre.
• Ensemble de mesure de cuillère.
• Pipette.
• Autocuiseur pour stériliser le matériel.
• Capot tel qu'un bac en plastique avec des trous renversés.
• Un flacon pulvérisateur.
• Mélange de conservateurs végétaux (PPM).

Préparation des milieux pour les plantes de culture tissulaire :

Le milieu des plantes de culture tissulaire est composé de macronutriments, micronutriments, vitamines, régulateurs de croissance, et des glucides ou du saccharose. Ces éléments sont communs à la plupart des plantes et sont conçus par Murashige et Skoog. Certains groupes spéciaux de plantes comme les conifères peuvent nécessiter des nutriments supplémentaires. Les constituants généraux des médias sont :

• Des minéraux pour soutenir la vie des plantes
• Le magnésium fait partie des molécules de chlorophylle.
• Le calcium est le composant de la paroi cellulaire.
• L'azote fait partie des acides aminés, protéines, vitamines, un acide nucléique.
• Ferreux, zinc, et le molybdène font partie des enzymes.
• Outre ces éléments, les plantes ont besoin d'éléments supplémentaires pour leur croissance, tels que le carbone, hydrogène, oxygène, phosphoreux, soufre, potassium, manganèse, le cuivre, sodium, silicium, nickel, cobalt, vanadium, sélénium, et le bore.
• Il y a des nutriments organiques produits par les plantes elles-mêmes, mais pour la culture tissulaire, ces suppléments doivent être fournis comme la Thiamine (vitamine B1), Niacine (vitamine B3), Pyridoxine (vitamine B6), et Myo-inositol (complexe de vitamine B).
• En dehors de ceux-ci, la culture tissulaire chez les plantes nécessite des régulateurs de croissance tels que l'auxine (pour la division cellulaire et la synthèse de la paroi cellulaire), Cytokinine (stimule la multiplication des pousses), Gibbérellines (développement des plantules).

Préparation des milieux pour les plantes de culture tissulaire :

C'est une tâche très difficile de peser chaque constituant pour préparer le milieu pour chaque tissu végétal. Donc, commodément, le stock du milieu est préparé et stocké dans le réfrigérateur et régulièrement vérifié pour la contamination ou la précipitation. Les milieux communs utilisés pour la culture tissulaire sont facilement disponibles sur le marché avec une spécification pour chacun.

• Milieu de White (le premier milieu pour la culture tissulaire).
• Milieu MS (milieu couramment utilisé préparé par Murashige et Skoog).
• Milieu B5 (utilisé pour la suspension cellulaire, culture des callosités, et maintenant pour la culture de protoplastes développée par Gamborg).
• Milieu N6 (utilisé pour la culture d'anthères de céréales).
• Milieu de Nitsch (utilisé pour une autre culture).

Un exemple du processus de mélange de médias est décrit ici :

Le récipient de 1 litre est rempli de trois tasses d'eau.

2,2 g ou un demi-sachet de MS medium avec 2 cuillères à soupe de sucre sont ajoutés et bien mélangés.

1 ml de BAP (benzyl adénine) et 1 ml de PPM (mélange conservateur de plantes) sont ajoutés à cette solution.

De l'eau est ajoutée pour faire 1 litre du mélange. Le pH de la solution doit être compris entre 5 et 6 ou 5,6 à 5,8. Si le PH est acide, ajouter une petite quantité de bicarbonate de soude et bien mélanger. Sinon si le PH est basique alors ajoutez quelques gouttes de vinaigre et mélangez bien.

Distribuez le milieu dans le pot pour bébé une fois que le pH requis est atteint. Chaque pot peut contenir 25 ml de solution.

L'agent gélifiant agar 30 ml ou 50 ml est ajouté aux 25 ml de solution.

Les pots sont bouchés et placés dans des conditions de chaleur comme au micro-ondes, cocotte minute, etc. pour la stérilisation.

Milieux de stérilisation et explants pour plantes de culture tissulaire :

Les milieux utilisés pour la culture des plantes sont placés dans un récipient en verre et scellés avec des fermetures en coton ou en plastique et sont stérilisés par la méthode par autoclavage pendant 30 min à 15 livres par unité carrée de pression. Les vitamines, acides aminés, les hormones, et d'autres extraits de plantes sont détruits lors de l'autoclavage, par conséquent, la solution de ces composés est stérilisée par l'utilisation de papier filtre Millipore avec un diamètre de pores de 0,2 micromètre. Lorsque de vieux arbres ou plantes sont sélectionnés pour la culture tissulaire, la stérilisation de l'explant est un problème grave en raison de la contamination. Les spores des plantes sont éliminées à l'aide d'insecticides et de pesticides et en recouvrant les pousses d'une couche mince, sachets de film transparent avant de collecter l'explant. La surface étant contaminée par des microbes, elle est donc soigneusement stérilisée avant d'être plantée dans le milieu nutritif. Hypochlorite, éthyle, et l'alcool isopropylique sont utilisés comme solutions de stérilisation de surface pour les tissus végétaux. Les explants sont d'abord lavés à l'eau distillée ou à l'eau tiède pendant 20 à 20 minutes pour éliminer les particules de poussière, puis avec une solution détergente, et enfin avec 0,1% de solutions de HgCl2 et NaCl pendant cinq minutes. Les explants sont à nouveau lavés avec de l'eau distillée stérilisée pour éliminer les segments nodaux stériles des explants. L'utilisation de pinces stériles pour manipuler le tissu ou l'explant est un must.

Agents gélifiants pour plantes de culture tissulaire :

Pour la culture de tissus chez les plantes si un milieu liquide est utilisé, il existe alors un risque de submersion des tissus et de manque d'apport d'oxygène pouvant entraîner la mort des tissus. Pour surmonter ce problème, un agent gélifiant est utilisé. Les agents gélifiants doivent avoir une propriété hautement essentielle pour la culture tissulaire, c'est-à-dire que l'agent doit former un liquide lorsqu'il est chauffé, deviennent semi-solides une fois refroidis et résistent à la stérilisation. Les gélifiants les plus couramment utilisés sont l'Agar, Agarose, et Gelrite. Les autres gélifiants disponibles sont les gommes Gellan, Acide alginique, et Gelcarine. Le gel est principalement utilisé pour raffermir les médias; il est donc ajouté sous forme de poudre et chauffé de manière à atteindre la température d'ébullition. Alors que les médias se refroidissent, il forme le gel. Ce gel est une surface solide partielle pour ancrer l'explant d'être submergé, mais suffisamment doux pour aider les explants à absorber les nutriments. Les mélanges de milieux sont facilement disponibles sur le marché avec l'agent gélifiant et les hormones qui y sont ajoutés. Par exemple, pour les médias MS, 1 litre de solution nécessite 4,33 g du mélange pré-fait, mais si un gélifiant est également présent comme la gélose, 1 litre de solution nécessite 9 à 12 g de mélange.

Lisez ceci :Questions et réponses sur la culture de tissus végétaux.

Multiplier et faire pousser les plantes de culture tissulaire :

Au fur et à mesure que l'explant est établi dans le milieu, il doit être cultivé dans des conditions d'éclairage bonnes et modérées. La photopériode doit être longue. La température doit être stable autour de 25 degrés Celsius mais peut varier entre 22 et 28 degrés Celsius. Lorsque le tissu ou l'explant cesse de croître, il est temps de les remplacer ou de les diviser pour former des sous-cultures. Pour ce faire, l'espace de travail stérile requis et les médias sont préparés. Pour remplacer le tissu, il suffit de le retirer du pot et de le replacer dans le nouveau pot avec le milieu. Mais si le tissu doit être divisé, la zone de travail stérile est configurée pour couper le tissu en morceaux et les placer dans des bocaux. Les instruments utilisés pour la coupe doivent être stérilisés avant utilisation.

Conditions de pré-transplantation pour les plantes de culture tissulaire :

C'est l'étape de la culture tissulaire où les pousses ou les plantules qui ont poussé sont stimulées pour la croissance et le durcissement des racines. Il est également effectué dans l'environnement interne tel qu'un tube à essai. Après le processus de micropropagation, la croissance des racines est une exigence essentielle et ne se produit pas dans les premiers stades. Les plantules sont mises dans un milieu qui stimule la croissance et l'initiation racinaire tel que l'Auxine.

Le durcissement prépare la plante à être cultivée en milieu naturel. Étant donné que les plantules sont cultivées dans une zone conditionnée, elles ont besoin de temps pour s'adapter à l'environnement extérieur. Les plantes deviennent sensibles aux maladies lorsqu'elles sont retirées de l'in vitro. Le durcissement des plantules consiste à les sevrer lentement de constantes, humidité élevée stable, lumière faible, et des niveaux d'environnement chaud à une lumière variable et instable, humidité, et les niveaux de température. L'environnement extérieur est également maintenu à des niveaux d'humidité élevés par un arrosage par brumisation ou en plaçant des couvertures en plastique avec un trou sur les plantes.

Ex Vitro pour les plantes de culture tissulaire :

Pour transférer les plantes dans le milieu naturel extérieur, il est très important que le milieu de culture tissulaire des racines soit retiré. Pour ce faire, les plantules sont placées sous l'eau chaude courante de telle sorte que la force de l'eau nettoie en profondeur le substrat des racines. Si cela n'est pas fait, il y a alors un risque que les moisissures (champignons) se nourrissent du support et détruisent les plantes. Le traitement des plantes doit être le même qu'ils ont été traités in vitro. La couverture de sacs en plastique sur les plantes doit rester pendant une semaine jusqu'à ce que les plantes s'adaptent à l'environnement naturel. Les plantes doivent être conservées à l'abri de la lumière directe du soleil et une fois qu'elles ont durci, elles peuvent être traitées comme n'importe quelle autre plante cultivée dans le sol.

L'avenir des usines de culture tissulaire :

L'industrie agricole peut devenir durable avec de faibles intrants énergétiques et des rendements de haute qualité avec l'aide de la biotechnologie. La technique de la culture tissulaire chez les plantes permet de produire des plantes de qualité supérieure, mais leur potentiel n'a pas été exploité dans de nombreux pays en développement. L'indice de performance des plantes cultivées en tissus est élevé par rapport aux plantes propagées de manière conventionnelle. Le marché pour une variété améliorée de plantes peut être lent si le taux de multiplication est lent. La culture tissulaire peut aider à accélérer ce processus grâce à une propagation plus rapide. L'utilisation de produits chimiques est également réduite car les plantes sont cultivées dans un environnement résistant aux maladies. L'importance de la culture de tissus dans les plantes devrait être reconnue et mise en œuvre pour une plus grande production agricole et également pour générer des emplois ruraux dans les pays en développement.

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