La protéinase de type subtilisine (AprBp) de Bacillus pumilus 3-19 est un candidat prometteur pour une utilisation industrielle en tant qu'additif alimentaire. Cependant, afin d'obtenir un rendement élevé de l'enzyme, il est nécessaire de développer un système d'expression très efficace.
Le but de l'étude était d'obtenir une expression stable du gène de la protéase de B. pumilus 3-19 dans le système d'expression de Pichia pastoris et d'évaluer la corrélation de l'activité enzymatique avec le choix du type de vecteur et des peptides signal. Dans cette étude, pour l'expression stable du gène de protéase optimisé dans des cellules de levure méthylotrophe, les vecteurs pPINK-HC et pPINK-LC ont été sélectionnés. Pour la sécrétion extracellulaire de protéase recombinante, un ensemble de peptides signaux efficaces a été utilisé. La préséquence du facteur de conjugaison a conduit à plusieurs reprises à une augmentation de la sécrétion de protéines recombinantes. D'autre part, les séquences des peptides signaux tueurs et lysozymes n'ont pas été utilisées auparavant pour l'expression de la protéase bactérienne chez P. pastoris.
Les colonies de transformants avec des constructions basées sur le vecteur pPINK-LC ont été détectées au 3ème jour d'incubation et ont montré une efficacité de transformation plus élevée que pour les colonies avec des constructions basées sur le vecteur pPINK-HC, qui n'ont été détectés qu'au 7ème jour d'incubation. L'efficacité de transformation au 10ème jour d'incubation pour les structures basées sur le vecteur pPINK-LC était en moyenne de 1,3x103 transformants/μg d'ADN, tandis que 1,03 x 103 transformant/μg d'ADN a été enregistré pour les constructions avec le vecteur pPINK-HC. La PCR des colonies a montré que toutes les colonies transformées sélectionnées contenaient le gène de la protéase de type subtilisine intégré dans le génome de la levure.
L'étude a montré que le temps d'incubation affecte la synthèse de protéase chez P. pastoris, et l'activité maximale de l'enzyme a été observée. Les souches de levure avec des constructions basées sur le vecteur à faible nombre de copies pPINK-LC ont montré une activité de protéase plus élevée (U/ml) dans l'hydrolyse de l'azocaséine (2,63 ± 0,16 pour le peptide de signal tueur (SP), 2,49 ± 0,08 pour la préséquence du facteur d'accouplement α, 2,19 ± 0,11 pour le lysozyme SP) que les souches avec des constructions basées sur le vecteur pPINK-HC (1,86 ± 0,09 pour killer SP, 2,21 ± 0,07 pour la préséquence du facteur d'accouplement α, 1,31 ± 0,11 pour le lysozyme SP), quel que soit le peptide signal utilisé. L'activité protéasique maximale a été obtenue pour les souches de levure avec les constructions pPINK-LC-killer-aprBp (5,75 ± 0,08 U/ml) et pPINK-LC-α-mat.factor-aprBp (4,33 ± 0,07 U/ml).
Cette étude a démontré que la protéase de type subtilisine des souches recombinantes de P. pastoris présente une activité protéolytique, qui dépend du temps d'incubation et du choix du peptide signal et du vecteur. La production de protéase bacillaire par le système d'expression hétérologue à base de levure rend ce système prometteur pour le développement de nouveaux additifs alimentaires pour l'élevage.
Les protéases sont classées parmi les trois plus grands groupes d'enzymes industrielles et représentent environ 60% du total des ventes mondiales d'enzymes, dont 40% appartiennent à des protéases bactériennes. Les sérine protéases bactériennes ont une large spécificité de substrat, et haute résistance à diverses conditions, qui justifie leur utilisation en biotechnologie, en particulier comme bioadditifs pour les oiseaux et les animaux d'élevage. En outre, compléter les aliments avec des protéases améliore l'absorption des acides aminés par les animaux et permet d'économiser des fonds pour l'achat d'acides aminés synthétiques. Il a également été démontré que l'utilisation de protéases comme additifs alimentaires augmente la biodisponibilité de l'azote, ce qui à son tour réduit les niveaux de pollution par l'ammoniac dans le sol. Aussi, les protéases facilitent l'action d'autres enzymes et augmentent la rentabilité des aliments, ainsi que favoriser la croissance de la microflore bénéfique dans les intestins des poulets de chair.
Aujourd'hui, un nombre limité de protéases commerciales de fabricants étrangers sont utilisées en Russie. Les principaux représentants sur le marché russe sont les additifs alimentaires importés CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), ETATS-UNIS), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), La Suisse), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Allemagne). Le recombinant obtenu comprend des souches de P. pastoris avec le gène de la protéase bacillaire de type subtilisine (aprBp) et trois peptides signaux différents (facteur -mating, protéine tueuse et lysozyme). Une expression et une purification supplémentaires de la protéase à partir du liquide de culture de levure et l'étude de ses propriétés biochimiques et enzymatiques permettront d'évaluer les perspectives biotechnologiques de l'enzyme recombinante.
En savoir plus sur l'étude, Expression hétérologue de la protéase de Bacillus pumilus 3-19 chez Pichia pastoris et son utilisation potentielle comme additif alimentaire en aviculture
