Techniques de culture tissulaire

Techniques de culture tissulaire chez les plantes, Procédure de prêt d'installation de culture tissulaire et de développement de culture tissulaire.

Introduction:

Qu'est-ce que la culture tissulaire ? La culture tissulaire est la culture d'une plante lors de l'utilisation d'une bouture ou d'un autre tissu végétal. La culture de tissus est la forme la plus courante de reproduction et de clonage de plantes en serre. La culture de tissus peut être utilisée pour reproduire des plantes qui démontrent une résistance exceptionnelle aux maladies, ou une autre caractéristique souhaitée. Le tissu cultivé peut être constitué d'une seule cellule, une population de cellules, et une partie d'un organe. Les cellules en culture peuvent se multiplier; changer la taille, former, présenter une activité spécialisée; ou interagir avec d'autres cellules.

Les techniques de culture tissulaire sont souvent utilisées pour la fabrication commerciale de plantes ainsi que pour la recherche sur les plantes. La culture tissulaire implique l'utilisation de petits morceaux de tissu végétal, qui sont cultivés dans un milieu nutritif dans des conditions stériles. En utilisant les conditions de croissance appropriées pour chaque type d'explants, les plantes peuvent être amenées à créer rapidement de nouvelles pousses, et, avec l'ajout d'hormones appropriées de nouvelles racines. Ces plantules peuvent être divisées, produire un grand nombre de nouvelles plantules. Les nouvelles plantes peuvent ensuite être placées dans le sol et cultivées de manière normale. Milieux de culture tissulaire , c'est un groupe de systèmes utilisés pour cultiver des cellules végétales, tissus ou organes dans des conditions stériles sur un milieu de culture nutritif de composition connue. La culture de tissus végétaux est largement utilisée pour générer des clones d'une plante dans une méthode connue sous le nom de micropropagation.

Importance de la culture tissulaire :

• Dans un temps et un espace relativement courts, un grand nombre de plantules peut être produit à partir d'un seul explant.
• La prise d'un explant ne détruit généralement pas la plante mère, Ainsi, les plantes rares et menacées peuvent être clonées en toute sécurité.
• Il est facile de sélectionner les traits souhaitables directement à partir de la configuration de la culture (in vitro) diminuant ainsi la quantité d'espace nécessaire, pour les essais sur le terrain.
• Une fois établi, une ligne de culture tissulaire peut fournir un approvisionnement continu de jeunes plants tout au long de l'année.
• Le temps nécessaire est beaucoup plus court, pas envie d'attendre tout le cycle de vie du développement des semences. Pour les espèces qui ont des temps de génération longs, bas stade de la production de semences, ou des graines qui ne germent pas facilement, une propagation rapide est possible.
• Plantes cultivées in vitro généralement libres, des maladies bactériennes et fongiques. Éradication des virus et maintien des plantes à l'état exempt de virus. Cela facilite la progression de la plante au-delà des frontières internationales.
• Les banques de cultures de tissus végétaux peuvent être congelées puis régénérées par culture de tissus. Il préserve les collections de pollen et de cellules à partir desquelles les plantes peuvent être propagées.

Types de culture tissulaire :

Culture de semences

La culture de graines est le type de culture de tissus qui est principalement utilisé pour les plantes telles que les orchidées. Pour cette méthode, les explants sont obtenus à partir d'une plante dérivée in vitro et introduits dans un environnement artificiel, où ils arrivent à proliférer.

Culture d'embryons

La culture d'embryons est le type de culture de tissus qui implique l'isolement d'un embryon à partir d'un organisme connu pour une croissance in vitro. La culture d'embryons peut occuper l'utilisation d'un embryon mature ou immature. Alors que les embryons matures en culture sont principalement obtenus à partir de graines mûres, implique l'utilisation d'embryons immatures provenant de graines hybrides qui n'ont pas germé. Ce faisant, l'embryon est finalement capable de créer une plante viable. Pour la culture d'embryons, l'ovule, la semence à partir de laquelle l'embryon doit être obtenu est stérilisée, et l'embryon n'a pas besoin d'être stérilisé à nouveau. Le saccharose salé peut être utilisé pour donner à l'embryon des nutriments. La culture embryonnaire est enrichie en composés organiques ou inorganiques, des sels inorganiques ainsi que des régulateurs de croissance.

Culture des callosités

La culture du cal est formée par la prolifération du tissu parent. Les cellules d'un cal sont parenchymateuses, amorphe &inorganisé. Généralement, la culture du cal est formée à la suite d'une blessure aux extrémités coupées d'une tige ou d'une racine. Un centre d'activité localisé est enregistré dans un cal.

Culture d'organes :

Cela peut permettre la différenciation et la préservation de l'architecture. La culture d'organes fait référence à la culture in vitro et au maintien d'un organe excisé primordial ou de tout ou partie d'un organe dans le sens et la fonction.

Culture anthère

L'androgenèse est le développement in vitro de plantes haploïdes provenant de puissants grains de pollen à travers une série de divisions et de différenciations cellulaires.

Embryogenèse somatique

C'est le processus d'une cellule ou d'un groupe de cellules initiant la voie de croissance qui conduit à la régénération reproductible d'embryons monozygotes capables de germer pour former des plantes complètes.

Traitement des cellules et tissus cultivés :

Les cultures vivantes peuvent être examinées directement au microscope, ou ils peuvent être observés au moyen de photographies et d'images animées prises au microscope. Cellules, tissus, et les organes peuvent être tués, fixé, et colorées pour un examen plus approfondi. Après fixation, les échantillons peuvent être incorporés et coupés en sections minces pour révéler des détails supplémentaires sous un microscope optique ou électronique.

Les cellules en culture de tissus végétaux sont soumises à une large gamme de traitements expérimentaux. Par exemple, virus, médicaments, vitamines, des micro-organismes pathogènes peuvent être ajoutés à la culture. Les scientifiques observent ensuite les cellules, rechercher des changements globaux dans le comportement cellulaire pour des changements dans des molécules spécifiques, telles que des altérations de l'expression d'une protéine particulière.

Aperçus biologiques :

La culture de tissus végétaux a permis de nombreuses découvertes en sciences biologiques. Il a révélé, informations de base sur les cellules concernant leur composition et leur forme; leur biochimie, génétique, et l'activité reproductive; et leur alimentation, métabolisme, fonctions spécialisées. C'est aussi des processus de vieillissement et de guérison; les effets sur les cellules de physique, chimique, et agents biologiques; et les différences entre les cellules normales et les cellules anormales, comme les cellules cancéreuses. Le travail avec des cultures de tissus végétaux a aidé à reconnaître les infections, et anomalies chromosomiques, catégoriser les tumeurs, et pour formuler et tester des médicaments et des vaccins.

Depuis la découverte que certains virus se développent en culture tissulaire, la technique a été utilisée pour produire des vaccins contre la poliomyélite, rougeole, oreillons, et d'autres maladies infectieuses. Les cultures cellulaires ont produit des inhibiteurs viraux, y compris l'interféron. Les hormones sont produites à partir de cultures de cellules ou d'organes. Les globules blancs cultivés de deux individus peuvent être utilisés pour déterminer la compatibilité entre les donneurs potentiels et les receveurs de greffes de tissus.

Principales étapes de la culture de tissus végétaux :

Phase d'initiation :

La phase d'initiation est la première partie de la culture de tissus végétaux. Ici, le tissu d'intérêt est obtenu et stérilisé afin d'éviter que tout micro-organisme n'affecte négativement le processus. C'est au cours de cette phase que le tissu est initié à la culture.

Phase de multiplication :

La phase de multiplication est la deuxième étape de la culture tissulaire où le matériel végétal in vitro est redivisé puis introduit dans le milieu. Ici, le milieu est composé de composants appropriés pour la croissance, y compris les régulateurs et les nutriments. Ceux-ci sont responsables de la prolifération des tissus et de la création de multiples pousses.

Élongation:

Les plantes sont à nouveau transférées, dans la hotte à flux laminaire, sur un support qui allonge les pousses. C'est le stade où les tiges des plantes poussent en longueur et commencent à ressembler à de petites plantes.

Formation de racines :

C'est à ce stade que les racines se forment. Ici, des hormones sont nécessaires pour induire l'enracinement, &par conséquent des plantules complètes. Cela peut se produire dans le travail de culture tissulaire en serre, selon les espèces. Les pousses allongées sont coupées du tissu de base et placées sur des supports contenant des auxines, pour l'enracinement. Une fois les racines visibles, les plantes peuvent être plantées dans la serre. Les plantes provenant de l'environnement du laboratoire ont poussé à des humidités relatives élevées et sont très tendres. Ils doivent être examinés de très près lorsqu'ils sont déplacés vers la serre pour s'assurer qu'ils s'acclimatent correctement.

Matériel utilisé pour la culture tissulaire :

La propagation par culture tissulaire nécessite un certain nombre d'équipements de laboratoire. Les différents équipements et leurs fonctions sont;

Autoclave: La stérilisation de tous les appareils en verre et milieux de culture peut être effectuée au moyen de vapeur générée dans l'autoclave.

Balances analytiques ou du plateau supérieur : Pour une mesure précise des différents constituants des milieux de culture, ces soldes seraient nécessaires. La balance du plateau supérieur est utilisée pour mesurer de plus grandes quantités, tandis que la balance analytique est utilisée pour mesurer de plus petites quantités.

pH-mètre : Il est utilisé pour mesurer et ajuster la concentration en ions hydrogène du milieu de culture ou de la solution. La concentration en ions hydrogène doit être maintenue avec précision pour obtenir une croissance optimale des plantes.

Armoires à flux d'air laminaire : Dans ces armoires, les pousses développées sur les explants sont séparées des grappes et transférées dans un milieu frais dans des conditions stériles.

Ensembles de distillation : L'eau à utiliser pour la préparation des milieux de culture doit être exempte de toutes impuretés et sels.

Climatiseurs avec stabilisateurs : Maintien de la température préférée en chambre de croissance, une salle d'inoculation ou une salle de transfert de culture serait possible avec la climatisation de ces zones.

Microscopes : a) Stéréomicroscope :Cela permettrait de disséquer des méristèmes de petite taille à partir des extrémités des pousses en enlevant les couvertures protectrices des primordiums des feuilles.

1. b) Microscope composé :Ceci permet la détection des bactéries et des champignons dans la culture et les tissus végétaux.

Unité de lavage de bouteilles : Étant donné qu'un grand nombre de bouteilles ou de récipients dans lesquels les plantes seront développées doivent être lavés à plusieurs reprises avant utilisation, une unité de lavage automatique des bouteilles serait utile.

Plateaux : Structure de support pour flacons ou récipients de culture.

Trappes : Passer à travers des boîtes utilisées comme passerelle entre la zone propre et la zone semi-propre pour l'échange de matériaux.

Kits de dissection : Ceux-ci sont nécessaires pour la séparation des pousses et la préparation des micro-boutures.

Utilisations de la culture de tissus végétaux :

La culture de tissus végétaux est utilisée pour augmenter des milliers de plantes génétiquement identiques à partir d'une seule plante parente appelée clones soma. Étant donné que ce processus de micropropagation produit de nouvelles plantules par dizaines de milliers, il a été largement utilisé pour la fabrication de plantes commercialement importantes, y compris les plantes alimentaires comme tomate , banane , et Pomme , etc. Un exemple d'application de la micropropagation a été observé dans l'élevage d'orchidées alors qu'elle augmentait de façon exponentielle en raison de l'accessibilité de millions de plantules grâce aux méthodes de culture tissulaire. Pourquoi la culture de tissus végétaux est-elle importante ? Dans cette culture, le milieu de croissance ou la solution de culture est très important car il est utilisé pour la croissance des tissus végétaux car il contient divers nutriments végétaux sous forme de «gelée» connue sous le nom d'agar et d'hormones végétales qui sont nécessaires à la croissance des plantes.

Exigences de la culture de tissus végétaux :

Portée et formation de la culture de tissus végétaux, il s'agit de la culture in vitro de plantes, graines et diverses parties des plantes (organes, embryons, tissus, cellules individuelles, et protoplastes).

La culture de tissus végétaux est l'un des domaines de la biotechnologie à la croissance la plus rapide en raison de son potentiel élevé de développement de cultures et de plantes ornementales améliorées. Avec les progrès réalisés dans la culture tissulaire, La technologie, il est maintenant probable de régénérer des espèces de n'importe quelle plante en laboratoire. Pour obtenir l'objectif de créer une nouvelle plante ou une plante avec les caractéristiques souhaitées, la culture tissulaire est souvent associée à la technologie de l'ADN recombinant. Les techniques de culture de tissus végétaux ont largement contribué à la révolution verte en améliorant le rendement et la qualité des cultures. Les informations obtenues à partir des cultures de tissus végétaux ont contribué à notre compréhension du métabolisme, croissance, différenciation et morphogenèse des cellules végétales. En raison de la large gamme d'applications, la culture de tissus végétaux attire l'attention des biologistes moléculaires, phytogénéticiens &industriels. Qui a introduit la culture de tissus végétaux ? Dans le 19ème siècle, l'idée d'expérimenter avec des tissus et des organes de plantes dans des conditions de laboratoire contrôlées est née. Pour la première fois en 1902, un physiologiste allemand, Gottlieb Haberlandt, développé la théorie de la culture cellulaire in vitro.

Conformément à la technologie et à l'objectif de propagation de la culture tissulaire, diverses installations peuvent également être nécessaires ci-dessous ;

Terre: Il est nécessaire de créer un laboratoire, unité de plante mère, serre &bureau. Un espace peut être requis pour l'installation de puits tubulaires ou de puits creusés et le stationnement des véhicules.

Plantes mères : Les plantes mères fourniraient une source de tissus. Leurs performances doivent être testées avant utilisation, comme source d'explants. En cas de rapprochement avec des laboratoires bien établis, des explants provenant d'essais de plantes mères peuvent être disponibles gratuitement. Autrement, collection, l'entretien et le test des plantes mères supérieures seraient nécessaires.

Laboratoire: Un laboratoire de culture tissulaire comprend normalement une salle de préparation des milieux, salle de stockage multimédia, salle de vaccination, salle de transfert de culture, zone de lavage, etc. Le plan d'étage doit être conçu pour favoriser une efficacité maximale. La conception doit faciliter le maintien d'une température optimale, humidité, éclairage et aération. La conception correcte d'un laboratoire réduira non seulement la contamination, mais permettra également d'atteindre une efficacité de travail élevée. Des laboratoires correctement planifiés et conçus peuvent réduire à la fois les coûts opérationnels et énergétiques.

Serre en culture tissulaire : Dans la propagation de la culture tissulaire, une serre peut être nécessaire pour élever et entretenir les plantes mères afin que la croissance des organes adaptés à la culture tissulaire soit maximale en particulier dans le cas des plantes ornementales et pour durcir les plantules régulièrement dans un environnement naturel. La serre permettra le contrôle de l'intensité lumineuse et de l'humidité, ce qui est essentiel pour le durcissement des plantes.

Électricité: Comme il ressort des paragraphes précédents, aucun laboratoire de culture tissulaire ne peut fonctionner sans électricité. L'électricité est essentielle pour fournir l'intensité lumineuse requise aux tissus et pousses en croissance pendant qu'ils sont dans le laboratoire, pour faire fonctionner divers équipements et installations, qui comprennent des climatiseurs.

L'eau: Eau pour la croissance des plantes mères, durcissement des plantules, cantine, toilettes, etc. L'eau distillée est nécessaire pour la préparation des milieux de culture et des réactifs.

Matières premières: Matières premières nécessaires au projet de culture tissulaire, en dehors de l'explantation, sont différents constituants des milieux de culture.

Main-d'œuvre qualifiée : La culture de tissus végétaux est une opération hautement qualifiée. Ce serait, donc, être nécessaire que les travailleurs de laboratoire et de serre soient bien qualifiés et expérimentés dans la technologie. Leur formation dans des laboratoires commerciaux bien établis serait utile.

Étapes de la culture de tissus végétaux :

Quelles plantes sont cultivées par culture tissulaire ? Les nouvelles plantes peuvent ensuite être placées dans le sol et cultivées de manière normale. De nombreux types de plantes conviennent à une utilisation en classe. Chou-fleur , boutures de roses, Les feuilles de violette africaine et les tiges d'œillets produiront toutes facilement des clones par culture de tissus.

Préparation du milieu nutritif

Un milieu semi-solide est préparé dans de l'eau bidistillée contenant des macro éléments, microéléments, acides aminés, vitamines, source de fer, source de carbone comme le saccharose et les phytohormones. Le milieu est chauffé pour dissoudre la gélose et 25 ml à 50 ml sont distribués dans chaque flacon à col large. Les récipients contenant les milieux de culture sont ensuite scellés et stérilisés par autoclavage.

Mise en place d'une culture aseptique

Le matériau de départ pour la procédure est généralement une pointe de pousse en croissance active d'un bourgeon auxiliaire ou terminal ou une pointe de pousse d'une plante. La procédure de culture de tissus végétaux commence par la sélection de plantes mères ayant les caractéristiques souhaitées.

Ex-plante si possible, le tissu méristématique de la plante mère sélectionnée est isolé. Le tissu/explant excisé est lavé à l'eau puis rincé avec un désinfectant tel que la solution savlon ou Dettol suivi d'un lavage à l'eau stérile. Le tissu est ensuite trempé dans une solution d'eau de Javel à 10 % pendant dix minutes pour désinfecter le tissu végétal, tuant la plupart des organismes fongiques et bactériens. La procédure de stérilisation des explants dépend de l'espèce végétale et des types d'explants

Inoculation

Le processus d'inoculation est effectué dans des conditions aseptiques. Dans cette procédure, les explants ou les micro pousses sont transférés sur le milieu nutritif stérilisé.

Développement des plantes en chambre de croissance

Après l'inoculation du tissu végétal, les flacons sont scellés et transférés dans la chambre de croissance pour déclencher un processus de développement sous lumière diffuse à 23 à 27°C et 50 à 60% d'humidité relative. Les besoins en lumière et en température varient d'une espèce à l'autre et parfois au cours des différentes étapes de développement.

Les cultures sont observées quotidiennement pour la croissance et tout signe d'infection ou de contamination. Des cultures, qui ne présentent pas une excellente croissance ou infectés, sont mis au rebut. Les cultures saines se développent en petits bourgeons de pousse. Ceux-ci sont repiqués sur milieu frais après quatre semaines. Le nombre de repiquages ​​nécessaires est propre à l'espèce végétale, qui sont standardisés. Les pousses se développent généralement après quatre semaines. Après qu'un nombre suffisant de pousses se soit développé dans chaque conteneur, à une hauteur minimale de 2 cm, ils sont transférés sur un autre support pour initier la procédure d'enracinement. Le constituant du standard d'enracinement pour chaque espèce végétale est spécifique. Les racines se forment généralement en deux à quatre semaines. Les plantes à ce stade sont délicates et nécessitent une manipulation soigneuse.

Durcissement des micro-plantes

En raison de l'humidité très élevée à l'intérieur de la cuve de culture et des conditions artificielles de développement, les plantules sont tendres et ne sont donc pas prêtes à affronter les conditions du champ. Les plantes retirées du milieu stérile sont lavées et maintenues sous brume intermittente ou sont recouvertes de plastique transparent propre. Après 10 à 15 jours sous une humidité élevée, les plantes sont transférées en serre et maintenues pendant encore 4 à 6 semaines. Ils sont alors complets pour être transférés dans une nouvelle maison ou sur le terrain. Normalement, les plantes de culture de tissus végétaux sont vendues soit sous forme de plantes ex-agar, soit sous forme de plantes durcies de serre.

La procédure de culture de tissus végétaux :

Les parties de la plante utilisées pour la culture sont appelées explants. Les explants sont cultivés in vitro sur un milieu nutritif qui répond à ses besoins nutritionnels. Le milieu nutritif doit donner les éléments suivants :

1. Macronutriments - Cela inclut des éléments comme l'azote (N), phosphore (P), potassium (K), calcium (Ca), soufre (S) qui est nécessaire pour une croissance et une morphogenèse correctes.
2. Micronutriments – Éléments comme le fer (Fe), manganèse (Mn), zinc (Zn), etc., ce qui est crucial pour la croissance des tissus.
3. Source de carbone ou d'énergie - C'est l'un des principaux ingrédients cruciaux des milieux nutritifs. Le saccharose est la source de carbone largement utilisée parmi les autres glucides.
4. Vitamines, acides aminés, &autres sels inorganiques.

Les milieux de culture servent également de support pour fournir des régulateurs de croissance des plantes aux enjeux qui entraînent leur morphogenèse selon les besoins. Les tissus des explants perdent d'abord leur spécificité pour former une masse brune dure appelée cal. Le cal se divise ensuite pour augmenter un organe végétal ou une toute nouvelle plante en fonction de la quantité et de la composition des phytohormones fournies. L'ensemble de la procédure nécessite le maintien de conditions aseptiques strictes à tout moment, car une seule contamination peut ruiner tout un lot de plantes. Pourquoi la culture tissulaire est-elle appelée micropropagation in vitro ? La culture tissulaire est une méthode de propagation utilisée pour générer des plantes dans des conditions stériles. C'est ce qu'on appelle la micropropagation in vitro, car, les explants sont cultivés sur milieu &les ressources génétiques sont conservées sous forme de. Les plantes micropropagées sont exemptes de virus et présentent une productivité et un rendement accrus.

Avantages de la culture de tissus végétaux :

Multiplication en masse de clones d'élite : La micropropagation permet la création d'un grand nombre de plantes à partir de petits morceaux de la plante mère. La production nécessite des périodes de temps modérément courtes pour faire pousser des plantes. Selon les espèces en production, one ex-plant can be multiplied into several thousand plants in less than one year.

Plant improvement through tissue culture: Creation of superior varieties of agricultural crops is possible through plant tissue culture method, which otherwise is not possible during conventional plant breeding methods.

True to Type production: a Large number of true to the type plants can be propagated within a short time and space and that too throughout the year. Par exemple, it may be possible to propagate 2 to 4 lakhs of tissue cultured plants from a single bush or rose against 10 to 15 plants by conventional means. Aussi, it may take about 2 to 4 months to produce a healthy planting material by tissue culture means, whereas a minimum of 6 to 8 months is required for most species by the latest method of plant propagation.

Higher yields: Tissue Culture Plants may have increased branching &flowering, greater vigor and higher yield, mostly due to the possibility of elimination of diseases.

Beneficial when conventional propagation is difficult: The process may succeed to propagate plants where seeds or conventional propagation is not possible or undesirable.

Flexible method: The flexibility of nurseries can be better. As the capital investment on the mother plant is reduced to almost zero, it can be easier to adapt to changing conditions.

The innovation of new varieties: Plant tissue culture can be utilized for breeding new varieties.

Financial assistance in Tissue culture:

The tissue-culture export-oriented developments are eligible for refinance support by NABARD. Banks can provide loans for the activity provided the scheme is technically feasible &financially viable.

Bank Loan:

A bank loan of 75 to 80 % of the total cost of development shall be available from the financing institution. Bank loan considered in the model is 75%.

Le taux d'intérêt :

Banks are free to choose the rate of interest within the overall RBI guidelines issued from time to time. Cependant, the final lending rate has been considered as 12% for working out the bankability of the model project.